Что нужно для выделения биомолекулярного сигнала для остановки старения

17 сентября 2016

2017.01.29 11:23:21

Кушелев: Чтобы вернуть молодость по-настоящему у инвесторов появился конкретный шанс:

Виктория Соколик пишет:

Для экспериментального анализа микроРНК экзосом:
Top-quality miRNA studies from pure exosomes
Diagenode
New seamless exosome isolation solution for miRNA studies
Diagenode guarantees the purest isolation of exosomes from biofluids and liquid biopsies for:
High-quality CATS RNA-seq library preparation
High yields of miRNAs from our new superior exosome isolation workflow
Learn more about superior exosome isolation and miRNA-seq

2014.09.03 22:18:33

Старение является результатом незавершенной эволюции человека, поскольку жизнь напрямую зависела от адаптации к изменяющимся условиям внешней среды. Основная задача программы развития, заложенная в геноме человека, направлена на достижение полового созревания и оставление потомства. Дальнейшее состояние организма уже практически ничем не регламентируется, и ожидаемая продолжительность жизни особи напрямую зависит исключительно от внешних условий жизни.

Согласно современным взглядам, сам процесс старения начинается сразу же после окончания физического роста человека, когда достигается максимальная плотность клеток. Установлено, что в это время в крови начинает циркулировать фактор, или группа факторов, тормозящих рост органов и пролиферацию клеток, в том числе и стволовых. С этого момента начинается процесс, который упрощенно можно назвать «дифференцировкой организма»: происходит адаптация к внешним условиям жизни, элиминируются «неиспользуемые» клетки и ткани. Механизм, регулирующий реорганизацию жизнедеятельности органов и тканей после остановки роста, до сих пор остается практически неизученным. Сложность заключается в том, что рост тканей регулируется не только факторами, циркулирующими в крови, но и механизмами межклеточной «контактной» регуляции, а также нейрональной периферической активностью.

Исследования, проведенные на модели молодых и старых животных с общим кровообращением (гетерохронного парабиоза), показали, что взаимный обмен кровью приводит к обоюдным эффектам у молодых и старых животных. У старых животных после обмена кровью с молодыми на короткий срок улучшается регенерация мышц, генерация новых нервных клеток, когнитивные функции (1, 2). У молодых животных после обмена кровью со старыми тормозятся процессы генерации новых нервных клеток головного мозга, снижаются функции иммунной системы, снижается продукция половых гормонов и у самок наступает период «климакса» (2, 3, 4, 5). Разница состоит в том, что положительные эффекты у старых животных являются временными и быстро проходят, а отрицательные эффекты у молодых животных обладают длительным эффектом и приводят к снижению продолжительности жизни молодых мышей. Показано, что ряд факторов старой крови, в частности Эотаксин, частично коррелируют с возникающими возрастными изменениями у молодых животных (2). Однако элиминация подобных факторов из крови является довольно сложным процессом, поскольку большинство факторов продуцируется клетками большинства тканей организма.

Возрастные изменения активности головного мозга в целом, и ядер гипоталамуса в частности, до сих пор являются практически неизученными. Хотя большинство исследователей склонятся к выводу, что главный регулятор скорости старения расположен именно в структурах головного мозга. В 2013 году Zhang и его коллеги показали, что решающее значение в процессах старения у мышей может иметь гипоталамус. Они показали, NF-kВ-зависимая активация нейронов в гипоталамусе увеличивается с возрастом и, пришли к выводу, что активность гипоталамуса влияет на спад когнитивных и физических функций у мышей. Было также установлено, что IКК-? и NF-kB ингибируют продукцию гонадотропного рилизинг гормона (GnRH). Их исследования показали, что при введении GnRH замедляется процесс старения и улучшаются процессы нейрогенеза у мышей. Авторы пришли к выводу, что: 1) гипоталамус играет программную роль в процессе старения; 2) усиление продукции GnRH в гипоталамусе является возможной тактикой для увеличения продолжительность жизни (6).

В работах сотрудников нашего института было установлено, что слабая электрическая стимуляция отдельных ядер гипоталамуса приводит к улучшению состояния старых животных и увеличению продолжительности жизни [ Дубилей Т.А., 2009 ]. Однако механизм реализации этого воздействия остается до конца неизученным.

В настоящий момент существует несколько подходов к увеличению продолжительности жизни, но все они базируются либо на замещении в организме специфических биологически-важных молекул (например, введение GnRH), либо на использовании неспецифических блокаторов активности клеток (например, использование рапамицина). Но оба подхода имеют один недостаток ? они не устраняют причину старения и требуют проведение постоянных интервенций. Наш подход предполагает использование биотехнологических методов для локального специфического изменения активности транскриптома отдельных ядер гипоталамуса с целью увеличения продукции ряда биологически-важных молекул и увеличения продолжительности жизни.

Целью данного проекта является поиск генов, экспрессируемых в разных ядрах гипоталамуса, «включение» и «выключение» которых с использованием специфических микро-РНК (по отдельности, или в комбинации) будет способствовать улучшению физиологического состояния и увеличению продолжительности жизни экспериментальных животных.

Задачи проекта: проведение скрининга активности транскриптома отдельных ядер гипоталамуса, подбор специфических микро-РНК, введение которых в отдельные ядра гипоталамуса приведет к восстановлению синтеза специфических гормонов и увеличению продолжительности жизни.

Дизайн исследования:

1. Животные ? мыши самки линии С57BL/6 возрастом 3 мес (молодые), 10?12 мес (стареющие), 21?23 мес (старые).

2. Экспериментальные модели ? выделение отдельных ядер гипоталамуса и скрининг транскриптома (экспрессии генов), стереотаксическое введение микро-РНК стареющим животным, анализ биомаркеров старения, создание гетерохронных парабиотических пар (обычно тестирование факторов индуцирующих старение, экспериментально весьма сложно, поскольку старение наиболее часто используемого в эксперименте животного (мыши) длится 2 года. Поэтому тест-системой для поиска индукторов старения будет модель гетерохронного парабиоза, которая позволяет выявить первые признаки старения молодого партнера в течение 1,5 месяцев сосуществования его со старым, по разработанной нами схеме).

3. Методы ? qPCR, sequencing, hybridization in situ, immunohistochemistry, ELISA, проточная цитометрия.

4. Тестируемые показатели:
4.1. Уровень экспрессии генов в разных ядрах гипоталамуса.
4.2. Уровень половых гормонов в плазме крови.
4.3. Оценка состояния иммунной системы.
4.4. Сбор и криосохранение плазмы крови экспериментальных животных.

http://img-fotki.yandex.ru/get/5101/158 … 6_orig.png

Литература:

1. Conboy I.M., M.J. Conboy, A.J. Wagers, E.R. Girma, I.L. Weissman, T.A. Rando. Rejuvenation of aged progenitor cells by exposure to a young systemic environment // Nature, Vol 433, 17 February 2005.
2. Villeda SA, Luo, Mosher KI, Zou B, Britschgi M, Bieri G, Stan TM, Fainberg N, Ding Z, Eggel A, Lucin KM, Czirr E, Park JS, Couillard-Despr?s S, Aigner L, Li G, Peskind ER, Kaye JA, Quinn JF, Galasko DR, Xie XS, Rando TA, Wyss-Coray T. The ageing systemic milieu negatively regulates neurogenesis and cognitive function. Nature. 2011; 477:90–94.http://www.nature.com/nature/journal/v4 … 10357.html . Accessed July 11, 2014.
3. Pishel I, Shytikov D, Orlova T, Peregudov A, Artyuhov I, Butenko G. Accelerated aging versus rejuvenation of the immune system in heterochronic parabiosis. Rejuvenation Res 2012; 15: 239-248.
4. Butenko GM, Gubrii IB. Inhibition of the immune responses of young adult CBA mice due to parabiosis with their old partners. Exp Gerontol 1980;15: 605-10.
5. Губрий И.Б., Резников А.Г., Демченко В.Н., Бутенко Г.М. Прекращение овариальной цикличности у молодой мыши при парабиозе ее со старой // Бюлл. Эксп. Биол. Мед. ? 1987. ? № 2. ? С. 205?208.
6. Zhang G, Li J, Purkayastha S, Tang Y, Zhang H, Yin Y, Li B, Liu G, Cai D. Hypothalamic programming of systemic ageing involving IKK-?, NF-?B and GnRH. Nature. 2013; 497:211–216. http://www.nature.com/nature/journal/v4 … 12143.html .

Технология возвращения молодости в общих чертах определилась 1 , 2 , 3

1. Нужно идентифицировать сигнал отключения феноптоза во время беременности.
Для этого нужно:

А. пометить все сигналы эмбриона и выделить помеченные сигналы, попавшие в гипоталамус будущей матери.
Б. прочесть и составить карту сигналов "эмбрион-гипоталамус".
В. выделить из всех сигналов только те, которые отключают феноптоз.

2. Синтезировать сигналы, отключающие феноптоз в промышленных масштабах.

Идея эксперимента Кушелева, а позднее Золдракса была сформулирована и опубликована нами в 2010-ом году. В 2011-ом году наш сотрудник написал письмо профессору-геронтологу из Израиля. Ответа мы не получили, но в 2014-ом году группа геронтологов под начальством этого профессора провела эксперимент по нашей схеме: http://subscribe.ru/archive/science.new … 74455.html

Это - победа! Продемонстрирована возможность создания эликсира, возвращающего молодость. Ищите инвесторов, и мы омолодим планету.

Детализация эксперимента 2013

http://nano-world-articles.nethouse.ru/page/1024175

Подготовка эксперимента 2014, 2016

2014.08.10 08:01:49

[8:53:32] Кушелев Александр Юрьевич: Доброе утро!
[8:53:57] Кушелев Александр Юрьевич: Американские ученые уже смогли реализовать дорогой вариант "эликсира" на лабораторных животных
[8:55:11] Кушелев Александр Юрьевич: В 2012-ом году я написал статью: "Прожиточный минимум вампира", где показал теоретическую возможность омоложения млекопитающих путём ежедневной замены крови. Американцы этот вариант реализовали в 2014 году, доказав принципиальную возможность омоложения экспериментально.
[8:55:41] Кушелев Александр Юрьевич: Но этот вариант для человека обойдётся приблизительно в 500 долл. ежедневно (7 литров крови по цене донорской)
[8:56:10] Кушелев Александр Юрьевич: Теперь задача перешла из разряда: "Можно ли?" в разряд "как сделать дешевле"
[8:57:02] Кушелев Александр Юрьевич: В Киеве третий год идут наши совместные эксперименты по созданию эликсира, который будет стоить не 500 долл., а 20 копеек за один день "вечной" молодости.
[8:57:51] Кушелев Александр Юрьевич: Сейчас вопрос стоит о том, где найти инвесторов, которые оплатят праймеры, с помощью которых мы сможем выделить сигнал отключения старения (феноптоза) из 10 000 сигналов эмбриона.
[8:58:58] ТФ: Молодец

2014.08.11 08:34:01

[10.08.2014 23:07:22] *****: А.Ю., информация по элексиру перестала появляться, Вы не в курсе последних новостей?
[10.08.2014 23:14:43] Кушелев Александр Юрьевич: А где она появлялась?
[10.08.2014 23:16:00] *****: Вы обновляли или геронтолог, или были новости с проекта на indigogo
[10.08.2014 23:17:11] Кушелев Александр Юрьевич: Последнее, что я получил из Киева - это лабораторный журнал
[10.08.2014 23:19:41] *****: Высосаное из пальца противостояние Киева и Москвы никак надеюсь не сказывается на исследованиях?
[10.08.2014 23:21:45] Кушелев Александр Юрьевич: Это не из пальца. Это за денежки дяди Сэма...
[10.08.2014 23:22:54] Кушелев Александр Юрьевич: Не знаю, что сейчас в Киеве, но последний раз связь была недели две назад. Тогда всё было по-старому
[10.08.2014 23:23:51] Кушелев Александр Юрьевич: Задержка в создании эликсира связана с отсутствием праймеров
[10.08.2014 23:23:59] Кушелев Александр Юрьевич: А праймеры - это 100 000 долл.

2016.09.26 22:18:59

[19:43:22] Виктория Соколик: А.Ю. надо обсудить одну модель по эликсиру молодости.
[19:45:05] Кушелев Александр Юрьевич: Звука на этом компьютере нет. Так что могу пока только текстом.
[19:59:00] Виктория Соколик: Идея такая: четыре группы животных (например крыс) по 12 шт. 6 мальчиков и 6 девочек. Первая - контроль (стареет как может), вторая - группа сравнения 1 (в течение 1 год еженедельно или ежедневно? получают интраназально сыворотку крови молодых животных), третья - группа сравнения 2 (в течение 1 год еженедельно или ежедневно? получают интраназально сыворотку крови молодых беременных самок) и четвертая - (в течение 1 год еженедельно или ежедневно? получают интраназально сыворотку крови эмбрионов). Интраназальное не инвазивное введение сыворотки крови с экзосомами молодости позволяет вести длительный хронический эксперимент и достигать гипоталамуса минуя гемато-энцефалический барьер. Кроме этого мы сосредоточимся только на информационной составляющей, минуя дополнительные опции очищения крови реципиента от метаболитов в старости буферной системой "молодой" крови при объединении кровеносных систем.
[20:01:07] Кушелев Александр Юрьевич: Очень интересная идея. А Вы не могли бы изложить её на форуме лаборатории Наномир? Я сейчас не могу выходить на форум до среды. Основной компьютер сломался. А в среду уже смогу.
[20:01:41] Кушелев Александр Юрьевич: Основной вопрос: Хватит ли концентрации при таком способе введения?
[20:05:58] Виктория Соколик: Когда мы проверяли эффективность назальной терапии куркумина в липосомах в качестве противовоспалительного средства при амилоидозе на животных, концентрация куркумина была не просто малой, а сверхмалой. Объем вводимого раствора куркумина составлял 200 мкл, но ежедневно в течение 1 месяца. Эффект оказался весьма убедительным именно в отделах головного мозга.
[20:06:35] Кушелев Александр Юрьевич: Это понятно.
[20:07:12] Кушелев Александр Юрьевич: Если вводить сигнал, передаваемый в виде иРНК в экзосомах, то там тоже много не нужно. А если сыворотку крови, то это "другой компот"
[20:12:26] Виктория Соколик: Сыворотка составляет 1/2 - 2/3 объема крови: уже в 2 раза объем уменьшается. Можно пробовать подобрать эффективный объем сыворотки предварительно на четвертой группе + контроль. Это легче. Если будет наблюдаться дозо-зависимость, то это подтверждение наличия сигнала. Следующий шаг -- выделение сигнала.
[20:13:23] Кушелев Александр Юрьевич: Очень интересно...
[20:13:48] Кушелев Александр Юрьевич: У меня два разных менеджера интересуются, есть ли смета затрат для инвесторов?
[20:14:26] Кушелев Александр Юрьевич: Одну смету я им показываю (Киевскую), но может быть Вы можете составить смету на Ваш вариант исследования?
[20:22:54] Виктория Соколик: Эта идея пришла ко мне только сегодня. Надо ещё тщательно продумать контроль показателей старения (кроме времени жизни) на биохимическом, иммунологическом и нейрофизиологическом уровнях (статья расходов №1). Может какие-либо идеи найдутся у нашего киевского геронтолога. Пока могу только сказать, что животные в нашем виварии есть (корм для них! -статья расходов №2), а их понадобиться не 50 шт, а больше (источники сыворотки). Технически всё возможно, кроме как получать кровь у эмбрионов (ни разу не видела). И зарплата исполнителям (а ну-ка целый год мордоваться - статья расходов №3).
[21:30:13] Виктория Соколик: В моей постановке объединять кровеносные системы не понадобится
[21:32:17] Кушелев Александр Юрьевич: А Вы можете написать первую версию сметы? Пока будем обсуждать детали, глядишь и инвесторы подтянутся...
[21:35:28] Виктория Соколик: Дьявол прячется в деталях . Надо всё обдумать, обсудить и определить маркеры старения в динамике жизни наших экспериментальных животных (в том числе и малые/иРНК в сыворотке крови). Вот такой итоговый скрининг сигналов и будет дороже всего стоить. А без него нет смысла даже затеваться.
[21:36:01] Кушелев Александр Юрьевич: Ну так включить в смету эту работу. В чём проблема?
[21:36:27] Кушелев Александр Юрьевич: Написать минимум и максимум
[21:36:43] Кушелев Александр Юрьевич: Если всё до конца обдумывать, то время потеряем
[21:37:41] Виктория Соколик: А.Ю. для этой работы нужны не деньги, а время и мозги. Потерять время мы всегда успеем, если будем сначала делать, а потом думать
[21:38:37] Кушелев Александр Юрьевич: Так никто же не убеждает делать. Написать известную часть сметы, чтобы инвесторы подключились, начали зарплаты платить. Тогда и мысли будут быстрее шевелиться
[21:39:24] Кушелев Александр Юрьевич: Чтобы привлечь мозги, нужны, например, деньги на зарплату
[21:39:48] Кушелев Александр Юрьевич: Есть же инвесторы, которые это понимают
[21:40:12] Кушелев Александр Юрьевич: Они готовы платить за то, чтобы специалисты сконцентрировали свои мозги на данной проблеме.
[21:41:27] Кушелев Александр Юрьевич: Меня менеджеры спрашивают, есть ли смета, кроме Киевской? К инвесторам с пустыми руками не ходят. Нужно что-то показывать...
[21:42:26] Кушелев Александр Юрьевич: Один из менеджеров на форуме спрашивал, а сколько нужно денег для всей команды, а не только киевской группы.
[21:43:32] Кушелев Александр Юрьевич: Ещё один менеджер, который в Дмитрове живёт, сказал, что он работал с разными инвесторами. Без сметы они не воспринимают серьёзно.
[21:43:32] Виктория Соколик: А.Ю., я такой же бухгалтер как и Вы, поэтому предпочитаю наукой заниматься, а не сметы составлять.
[21:43:50] Кушелев Александр Юрьевич: Давайте найдём человека, который напишет.
[21:44:16] Кушелев Александр Юрьевич: Но ему нужно дать какую-то входную информацию, чтобы он начал искать цены и составлять смету
[21:44:36] Кушелев Александр Юрьевич: Например, нужно знать сколько примерно людей сможет выполнить работу
[21:44:52] Кушелев Александр Юрьевич: Какая у них типовая зарплата, он сам выяснит
[21:45:50] Кушелев Александр Юрьевич: Кстати, дмитровский менеджер готов написать смету, но ему нужно будет дать информацию, которую знаете только Вы
[21:46:31] Кушелев Александр Юрьевич: Названия работ, например.
[21:46:41] Кушелев Александр Юрьевич: Объёмы хотя бы прибизительно
[21:46:58] Кушелев Александр Юрьевич: И сроки хотя бы примерные по минимуму
[21:47:12 | Изменены 21:47:27] Кушелев Александр Юрьевич: А максимум - сам о себе скажет
[21:48:25] Кушелев Александр Юрьевич: Инвесторы по наличию сметы делают вывод о реальности работы
[21:48:35] Виктория Соколик: Для начала, я хотела бы обсудить эту идею со своим начальством. Если удастся запланировать тему в институте, это уже полдела. Вы же понимаете, что никого чужого со стороны в лабораторию института не пустят, а организовывать современную лабораторию под этот проект не по зубам даже группе инвесторов. Поэтому в проекте могут быть задействованы только мои коллеги.
[21:49:09] Кушелев Александр Юрьевич: Не понял.
[21:49:48] Кушелев Александр Юрьевич: А киевские геронтологи работают и со мной и с питерскими коллегами без проблем
[21:50:22] Кушелев Александр Юрьевич: Инвестор для киевского эксперимента покупал клетки. Другие инвесторы оплачивали корма
[21:50:28] Кушелев Александр Юрьевич: Медикаменты..
[21:50:38] Виктория Соколик: Кстати часть работ по скринингу малых и информационных РНК может быть выполнена в Полтаве в "мокром" эксперименте. Но для начала необходимо составить минимальный список каких.
[21:51:07] Кушелев Александр Юрьевич: В смете можно пока укрупнённо обозначить направления
[21:51:21] Кушелев Александр Юрьевич: И ориентировочно объёмы работ и количество задействованных специалистов
[21:51:49] Кушелев Александр Юрьевич: Инвесторы же не просто интересуются
[21:53:09] Кушелев Александр Юрьевич: Кстати, о книге "Пикотехнология белков"... А как узнать, заказал ли кто-то книгу в издательстве? Или это коммерческая тайна?
[21:54:03] Кушелев Александр Юрьевич: Я так понял, что библиотеки заказывать на будут.
[21:54:51] Виктория Соколик: Вряд ли в Киеве или Питере занимались подпольными исследованиями в пределах государственных учреждений. Если речь идёт не о НИР института, тогда заключаются договора об аренде помещений, коммунальных платежей, эксплуатации оборудования, животных вивария и т.д. Это такие ДЕНЬГИ, оно Вам надо? Ведь проект не на 1 месяц и не на 2, а года на 1,5-2. Не заметить невозможно.
[21:56:13] Кушелев Александр Юрьевич: В Киеве не занимались подпольными исследованиями. Они даже от имени института писали письма на таможню, чтобы клетки, которые инвестор оплатил в Китае, доставили в институт без пошлины
[21:56:17] Виктория Соколик: Издательство не предоставляет такой информации, наверно чтобы гонорар не платить. Я ни на что и не претендую в денежном эквиваленте.
[21:56:44] Кушелев Александр Юрьевич: Так издательство вроде и не предлагало авторских гонораров
[21:56:52] Виктория Соколик: Значит они оформили тему, например хоздоговорную
[21:57:01] Кушелев Александр Юрьевич: Это Ирина знает
[21:57:24] Кушелев Александр Юрьевич: Но корма инвесторы тоже оплачивали. И не было проблем.
[21:57:50] Кушелев Александр Юрьевич: И медикаменты мы с Ярославом отправляли в холодильнике поездом
[21:58:43] Кушелев Александр Юрьевич: Мне интересно, покупают книги "Пикотех" или "никому не надо"
[21:59:37] Кушелев Александр Юрьевич: Я так понял, что издательство как-то рекламирует свои книги
[21:59:38] Виктория Соколик: Там есть пункт, что если покупается определённое количество экземпляров, то автору в конце года присылают какой-то %. Если продается меньше, то предоставляется право выкупить любую из изданных ими книг льготно что-ли, как-то так.
[22:00:08] Кушелев Александр Юрьевич: Т.е. в новом году мы узнаем, продали что-то или нет?
[22:00:12] Виктория Соколик: Да рекламирует, размещая на электронных сайтах
[22:00:22] Кушелев Александр Юрьевич: Тогда ждём-С
[22:00:54] Кушелев Александр Юрьевич: Но цены у них, конечно, заоблачные 75 евро за книгу
[22:01:56] Кушелев Александр Юрьевич: Я бы набрал название книги в Гугле и купил электронный вариант у авторов
[22:02:33] Кушелев Александр Юрьевич: Тем более, что электронный вариант позволяет вести поиск по тексту книги, а бумажный нет...
[22:03:22] Виктория Соколик: А.Ю., продажа/покупка монографии - это стрельба из рогатки по воробьям. Я после защиты докторской буду лично предлагать нашей профильной научной элите её прочитать (в электронном виде). Сейчас не хочу дразнить гусей, поскольку дебаты как правило бывают жаркими
[22:03:52] Кушелев Александр Юрьевич: Понятно
[22:05:12] Кушелев Александр Юрьевич: А Вы в курсе, что физики из Германии "нащупали" кольцегранный микромир с помощью атомного силового микроскопа?
[22:05:36] Кушелев Александр Юрьевич: Так что дебаты будут не жаркими, а очень жаркими
[22:06:00] Виктория Соколик: Вы можете попросить инвесторов распечатать в любой типографии электронный вариант книги и суперобложку в придачу для авторов в подарок 2-3 шт. Номер там уже есть.
[22:06:25] Кушелев Александр Юрьевич: Кстати, классная идея!
[22:06:41] Виктория Соколик: Да в курсе. А Вы в курсе, что эта информация есть в монографии ?
[22:06:52] Кушелев Александр Юрьевич: Упс...
[22:07:28] Виктория Соколик: Только печать должна быть цветная, иначе смысла нет
[22:07:41] Кушелев Александр Юрьевич: Интересно, сколько стоит распечатать 3 экземпляра?
[22:08:12] Кушелев Александр Юрьевич: Если больше, чем по 75 евро, то проще в Германском издательстве купить
[22:08:38] Виктория Соколик: У них черно-белые варианты

2016.09.28 00:52:20

Создание средства для продления жизни

[22:36:57] Виктория Соколик: У меня есть уже три этапа исследования, но лучше я их завтра голосом расскажу.
[22:39:17] Кушелев Александр Юрьевич: Лучше текстом. Тогда это легко обсудить на форуме.
[22:40:10] Виктория Соколик: А.Ю., я вчера выложила на Вашем форуме нашу дискуссию и ни одного комментария.
[22:40:27] Виктория Соколик: С кем обсуждать?
[22:40:40] Кушелев Александр Юрьевич: Ничего страшного. Народ уже читает. Скоро подключится к дискуссии
[22:41:08] Кушелев Александр Юрьевич: Обратите внимание, что на форуме сейчас 23 читателя одновременно!
[22:42:16] Кушелев Александр Юрьевич: А мы ещё рассылку на эту тему можем сделать...
[22:42:26] Кушелев Александр Юрьевич: 3000 подписчиков
[22:42:57] Кушелев Александр Юрьевич: И на фейсбуке тоже около 3000 читателей
[22:44:39] Кушелев Александр Юрьевич: Кстати, на форуме уже 30 читателей
[22:44:49] Кушелев Александр Юрьевич: Может быть как раз Ваше сообщение их привлекло...

[22:48:35] Виктория Соколик:

Этап1. Выяснить природу сигнала от эмбриона. (Очень варварский и крайне сложный эксперимент): под УЗИ для животных (такие есть в ветклиниках) крысам-самкам во 2-ом триместре беременности (14 суток) в каждый эмбрион ввести двойную изотопную метку. Например, меченый аланин и меченый урацил. Далее декапетировать самок в динамике времени: 0,5 ч; 1 ч; 3 ч; 6 ч; 24 ч и 2-е сутки. В сыворотке крови и отделах головного мозга (гипоталамус, гипофиз, гиппокамп) регистрировать метку. Если обнаружим меченный урацил, то носитель сигнала -- РНК, если меченый аланин -- белки/пептиды. При положительном результате переходим к этапу 2.
[22:50:24] Кушелев Александр Юрьевич: Круто!
[22:50:58] Кушелев Александр Юрьевич: Золдракс как раз думал, как бы пометить, чтобы меченые молекулы не заполнили весь организм будущей матери
[22:52:25] Кушелев Александр Юрьевич: Но тут нужно отметить, что сигнал скорее всего сложный, т.е. не одна иРНК, а группа
[22:52:45] Кушелев Александр Юрьевич: А может быть и дублирование белковыми сигналами есть

[22:53:35] Виктория Соколик:

Этап 2. Из сыворотки крови беременных самок с изотопной меткой набором для выделения микроРНК выделить малые РНК и поставить их электрофорез в ПАГе с маркерами молекулярного веса. Покрасить гель бромистым этидием и в УФ вырезать отдельно все полученные фракции. На счетчики определить фракцию/ии микроРНК с изотопной меткой и следовательно молекулярный вес группы сигнальных микро РНК. При положительном результате переходим к этапу 3.

[22:53:36] Кушелев Александр Юрьевич: Для начала я хотел бы подключить к обсуждению Золдракса.
[22:54:21] Кушелев Александр Юрьевич: Очень круто. Но я пока не догоняю всех тонкостей...
[22:56:45] Кушелев Александр Юрьевич: Я написал Золдраксу в скайпе, но он пока не отвечает.

[23:02:27] Виктория Соколик:

Этап 3. Получить препаративное количество микроРНК из сыворотки беременных крыс во 2-ом триместре беременности. Сделать три концентрации микроРНК (например 2, 10 и 20). Упаковать в липосомы, чтобы на слизистой не разрушилось. Вводить старым крысам ежедневно на 100 мкл липосомной эмульсии с микроРНК в течение месяца. Зафиксировать исходные показатели и через месяц назальной терапии. Выявить действующую концентрацию. В качестве тестируемых маркеров можно померить наборами для ИФА например цитокины (TNFальфа, IL-10, IL-6) как показатель хронического неспецифического старческого воспаления. При положительном результате переходим к этапу 4.
[23:03:38] Кушелев Александр Юрьевич: Круто! А что говорит Ирина?
[23:05:34] Виктория Соколик: Ире идея понравилась, насчет маркеров старения нет никакой определённости. В целом она отошла от этого направления исследований и занимается геропротекторами для больных диабетом, инфарктом и т.д.
[23:06:06] Кушелев Александр Юрьевич: Обидно...

[23:08:13] Виктория Соколик:

Этап 4. С помощью праймеров и нуклеаз расшифровать нуклеотидные последовательности действующих микро РНК. Синтезировать нужное количество на амплификаторе. Использовать в следующем этапе тестирования.
[23:08:51] Кушелев Александр Юрьевич: ЗдОрово. Интересно, что скажет Золдракс...

[23:13:21] Виктория Соколик:

Этап 5. Упаковать в липосомы в выбранной действующей концентрации и использовать в эксперименте, описанном вчера, только вместо иммунологически опасной сыворотки крови крыс-беременных на 2-ом триместре беременности использовать липосомный препарат микроРНК определённого состава и определённой концентрации. В процессе работы надо провести скрининг биохимических, иммунологических и функциональных маркеров старения, кроме продолжительности жизни.
[23:19:18] Кушелев Александр Юрьевич: Да, очень круто! Мне в этом нужно тщательно разбираться. Надеюсь, что Золдракс быстро подключится. Может быть ему удастся найти какие-нибудь противоречия, которые ускользнули от Вас и Ирины. Я пока вообще не вижу никаких нестыковок, но они могут быть...

[23:21:48] Виктория Соколик: Вы конечно правы, нестыковки появятся "в случае отрицательного результата" на любом из этапов

Zoldrax

2016.09.28 00:27:38

Все мои рассуждения основаны только на предположениях.

Почему второй триместр, вроде-бы нужна вторая половина первого?

1. В крови матери плавает очень много ДНК плода. По ним можно восстановить большую часть генома плода. Урацил, конечно, будет встраиваться только в РНК, но их тоже будет плавать, скорее всего, по аналогии с ДНК, очень много разных, а нам нужны только те, которые запакованы в экзосомы, обладающие специфичностью к транспорту через гемато-энцефалический барьер. Без экзосом плацентарный барьер пройдут, скорее всего, только микро РНК, обладающие низкой специфичностью. Нам нужны, скорее всего, Small activating RNAs (saRNA). Белков, скорее всего, проходит очень много и аланин содержат почти все.

2. Да все хорошо, за исключением того, что это могут быть не microRNA, а saRNA, а они сохраняются, только в экзосомах, иначе их разрушит РНКаза. МикроРНК обладают шпилечной структурой, защищающей от РНКаз, но из за этого их множество и специфичность ограничены.

3. Я полагаю, что транспорт экзосом более специфичен, а ключ, например набор, интегринов в оболочке, гораздо сложнее простой упаковки в липосомы. Показаны механизмы специфичного транспорта экзосом через разные барьеры.

Боюсь, что без отделения сигналов в экзосомах от сободноплавающих РНК и белков не обойтись.

Я вот думаю, что может быть проще выделить и отсеквенировать все РНК из экзосом мыши до беременности и после. И найти отличия при беременности.

Я почти уверен, что сам сигнал возраста (старения) имеет кодовую модуляцию, т.е. от изменения концентрации в допустимых пределах эффект не меняется и на такую роль подходят только saRNA. А вот сигнал блокировки может быть каким угодно, в том числе и белковым, раз ложная беременность показала промежуточный эффект между беременными и небеременными гетерохронными парабионтами.

2016.09.28 23:13:46

Victoriy пишет:

Zoldrax пишет:

Все мои рассуждения основаны только на предположениях.
Почему второй триместр, вроде-бы нужна вторая половина первого?

Victoriy: Спасибо, что уточнили. Выходит, если у лабораторных крыс беременность 21 день, то нужны животные на 5-6 день беременности. А что во втором триместре "уже не тот компот"?

Zoldrax пишет:

Victoriy: Вот и хорошо, сравним электрофореграммы малых РНК сыворотки крови беременных крыс со спектром малых РНК из супернатантов целевых отделов головного мозга, чтобы найти те меченные изотопом фракции, которые пришли в мозг из эмбриона и миновали оба тканевых барьера (плацентарный и ГЭБ). Скорее всего это будет суммарная фракция microРНК+saRNA, поскольку у них близкий молвес.

Zoldrax пишет:

Victoriy: Вообще-то, saRNA тоже имеют двухцепочечную структуру. И потом, для защиты от разрушающего действия РНКаз все процедуры выделения и анализа нужно проводить в присутствие ингибиторов (в продаже есть много универсальных ингибиторных коктейлей).

Zoldrax пишет:

Victoriy: Так оно и есть. Но простые фосфолипид/холестериновые липосомы тоже не промах и замечательно справляются с бережной транспортировкой содержимого.
Если нам повезёт и удастся идентифицировать, например с помощью набора антител, меченную по аланину фракцию/ии белков в супернатантах головного мозга, то очевидно, что они из эмбриона и скорее всего пришли в составе экзосом. А далее ничего нам не может помешать встраивать сигнальный белок в липосомы, чтобы имитировать специфическую векторность экзосом.

Zoldrax пишет:

Боюсь, что без отделения сигналов в экзосомах от свободно плавающих РНК и белков не обойтись.

Victoriy: А я вот боюсь всего, что связано с выделением и сохранением целостности экзосом. Поэтому тщательно избегаю этого, как только могу. Вы хоть представляете себе эти длительные и многоступенчатые ультрацентрифугирования для получения конечного результата. Пересмотрите предлагаемые методики. В одних нет ЭДТА, который якобы разрушает липидный слой, в других он есть. В одних столько то тысяч об/мин, в других другое. И все они заканчиваются фразой: Недостатками способа являются недостаточная чистота целевого продукта (примесь микрочастиц диаметром 100-200 нм), длительность выделения экзосом (более 10 ч), высокая стоимость коммерческого набора для выделения экзосом, ограниченное количество экзосом, как следствие, полученные результаты о содержании малых РНК в составе экзосом являются недостоверными.

В своё время мне повезло и я проскочила период, когда липопротеины изучали методами ультрацентрифугирования. В моё время перешли к электрофорезу. Но я помню, что даже плотные липо-протеиновые комплексы разрушались в ходе фракционирования при больших g. Поэтому за судьбу мембранных пузырьков в таких условиях я не дам даже ломаного гроша.

Zoldrax пишет:

Victoriy: Поверьте, что не проще технически (см. выше) и главным камнем преткновения для Вас станет чистота и полнота фракции экзосом. (Читайте проддолжение, кликнув на дату публикации)